نویسنده : دکتر محمد زهرائی
اگزوزوم :
اگزوزوم ها ذراتی هستند کیسه مانند محتوای مولکول های بیولوژیک که از سلول ها ترشح میشوند، نام عمومی تر آنها Extracellular Vesicles (EVs) میباشد؛ این وزیکل ها در سیستم اندوزومال اغلب سلولهای اوکاریوت (سلول های هسته دار) ایجاد میشوند. از سیستم اندوزومال ابتدا کیسه هایی پر از وزیکل به نام multivesicular body (MVB) جدا میشود ، که وزیکل های داخل آن Intraluminal vesicle(ILV) خوانده میشوند و وقتی کیسه MVB به سطح سلول میرسد غشاء دور آن با غشاء سلول یکی شده و وزیکل ها به خارج از سلول میریزند. دانش مربوط به اگزوزوم یکی از جدیدترین و جالب ترین مباحث علوم سلولی است، و یکی از مهمترین عملکردهای سلولی در جانداران چند سلولی، همین ترشح اگزوزوم میباشد، که در واقع به واسطه محتویات اگزوزوم و جذب اگزوزوم در سلول های دیگر و ورود محتویات اگزوزوم به سیتوپلاسم سلول جذب کننده و عملکرد ویژه این محتویات؛ سلول تولید کننده اگزوزوم بر روی سلول جذب کننده آن اثر میگذارد، در واقع اگزوزوم ها یک سیستم انتقال و تبادل اطلاعات مهم در بین سلول های مجاور هستند.
اگزوزوم ها در سال 1983 ابتدا در مورد رتیکولوسیت ها ( سلول پیش ساز گلبول قرمز ) کشف شده و و در سال 1987 این نام بر آنان گذاشته شد چون در ابتدا فقط تصور میشد حاوی مواد دفعی است به این نام نامیده شد اما واقعا مهمترین عامل ارتباط بین سلولی است ؛ و مرتبا عملکرد و کاربرد جدیدی برای اگزوزوم ها یافت میشود .
عملکرد اگزوزوم :
کارکرد و کاربرد اگزوزوم ها تاکنون در سه حوزه مهم ارزش و اهمیت پیدا کرده است :
اگزوزوم بعنوان خط ارتباطی سلول ها با یکدیگر
Intercellular communication ترشح اگزوزوم و جذب آن توسط یک سلول دیگر ، خط ارتباطی سلول ها یا یکدیگر است ؛ تسلط بر این خط ارتباطی و ایجاد پیام مناسب و تولید اگزوزوم با محتوای مناسب ، میتواند ما را عملا بر عملکرد یک سلول هدف مسلط کند ، و ما خواهیم توانست عملکرد سلول های خاص را طبق اهداف درمانی خود تنظیم کنیم که قدرتی بسیار مهم در درمان مبتنی بر استفاده از سلول است ، اینکار هم با آنالیز محتویات اگزوزوم هایی که سلول را وادار به عملکرد خاصی می کنند ؛ و سپس استفاده از آن محتوا میسر است ؛ هم با استفاده از اگزوزوم سلولی خاص که فعالیت خاصی از آن مورد نظر برای درمان است ؛ که با توجه به میزان بالای استفاده از سلولهای بنیادی مزانشیمی MSC اگزوزوم آن و خواص آن هم برای ما از همه شناختهشدهتر است . اما دو خی تحقیقی بسیار مهم در مورد اگزوزوم سلولهای ایمنی و اگزوزوم سلولهای سرطانی نیز تحقیقات بسیار زیادی را به خود جلب کرده است .
اگزوزوم بعنوان بیومارکر
حوزه دوم تحقیقات در این زمینه استفاده از اگزوزوم بعنوان بیومارکر است ، در واقع هر سلولی اگزوزوم های خاص خودش را تولید میکند و این اگزوزومها به جز تعامل با سلول های مجاور عملا در تمام بدن پخش میشوند . به این ترتیب میتوان از جستجوی اگزوزوم خاص برای تععین وجود سلولی خاص در بدن مثلا سلول سرطانی خاصی استفاده نمود همچنین محتویات اگزوزوم میتواند نمایشکر نوع عملکرد آن سلول نیز باشد .
سوء استفاده عوامل پاتوژن از اگزوزوم
حوزه سوم که اخیرا بشدت مورد تحقیق قرار گرفته اینست که بعضی از ویروس ها؛ از اگزوزوم بعنوان وسیله جابجایی استفاده میکنند ، مسئله قرار داشتن پارتیکل های ویروسی در اگزوزوم یا استفاده از آن در ورود به سلول از جنبه های جالب این حوزه است.
ساختار و محتوای اگزوزوم و اهمیت کاربردی آن :
اندازه اگزوزوم 30 بین تا 120 میکرومتر متغیر است؛ کیسه ای است کروی؛ با دو بخش مهم؛ جدار و محتویات :
جدار اگزوزوم از یک ساختار دو لایه لیپیدی ساخته شده است که یک ساختار کروی در اندازه گفته شده ایجاد میکند. جدار اگزوزوم نه تنها از نظر ایجاد هویت اگزوزوم و در بر گیری محتویات آن اهمیت دارد ، بلکه بواسطه عناصری که در سطح خود دارد عاملی است برای تعامل با غشاء سلول هدف و جذب توسط آن ، کمپلکس پروتئینی به نام tetraspanin که در غشاء همه سلول ها وجود دارد ، در غشاء اگزوزوم نیز وجود دارد و نقش مهمی را در جذب آن توسط سلول هدف بازی میکند . دیواره هر سلول و اگزوزوم تولید شده نیز ممکن است نوع خاصی از تتراسپنین آن را داشته باشد و انواع CD9, CD63 , CD81 در جدار اگزوزوم MSC وجود دارند.
همینطور مشابه جدار سلول منشاء انواع اگزوزوم کمپلکس MHC را در جدار خود دارند که در مورد اگزوزوم MSC ، مثل خود سلول MHC وجود ندارد و به همین جهت مثل خود MSC در تزریق آلوگرافت هیچگونه ایمونوژنیسته ایجاد نمی کند .
محتویات اگزوزوم عمدتا شامل مولکول های پروتئینی و نوکلئوتید است (اگرچه محتویات لیپیدی هم در آن وجود دارد)
محتویات پروتئینی متنوعی بویژه از گروه فاکتورهای رشد تا تنظیم کننده های رشد در اگزوزوم ها وجود دارد . در این مورد خاص (PD-L1), galectin-1و (TGF-β)وجود دارد و نیز باعث افزایش تنظیم کننده های ایمنی مثل IL-10میشود . البته لیست نسبتا طولانی از این پروتئین های موجب فعالیتهای مختلف هر بافت در مطالعات آورده شده مثل nuclear factor‐kappaB (NFkB) که باعث تسریع آنژیوژنز در بافت های دچار ایسکمی میشود .
محتویات نوکلئوتیدی شامل گستره وسیعی از انواع رشته های نوکلئوتیدی میشود که بخصوص mirRNA جلب توجه زیادی را ایجاد کرده .
DNA : در بعضی اگزوزوم ها وجود دارد و البته در مورد اگزوزوم های MSC وجود ندارد.
mRNA : با ورود به سلولو هدف میتواند باعث ساخته شدن پروتئین خاصی شود که باعث برآورده شدن عملکرد خاصی باشد.
microRNA) ,mirRNA) : یکی از مهمترین بیومولکول های موجود در اگزوزوم برای تحت تاثیر قراردادن سلول های هدف می باشد ؛ mirRNA یک توالی با 20 نوکلوئوتید یا بیشتر است که با چسبیدن به mRNA خاص باعث میشود که mRNA نتواند در محل صحیح خود در ریبوزوم قرارگرفته و ساخت پروتئین مربوطه بلوک شده و اتفاق خاص مربوط به عملکرد آن پروتئین از بین میرود ، به عبارتی یک سلول یک فعالیت خاص در سلول دیگر را مهار میکند ، البته ممکن است در شرایط خاص بیماری این فعالیت به ضرر خود سلول یا بافت باشد .
خط درمانی بسیار نوینی با استفاده از این بیومولکول ممکن است قابل ایجاد باشد و حجم بزرگی از تحقیقات نوین سلولی مولکولی بر آن متمرکز شده است ، اما نکته مهم اینکه وارد کردن آن به سلول نیاز به اگزوزوم و در واقع جدار اگزوزوم و جفت شدن تتراسپنین آن با گیرنده غشاء سلول دارد .
آینده درمان با اگزوزوم :
دو حیطه بزرگ در درمان با اگزوزوم پیش رو است : یکی در رابطه با محتویات آن؛یکی در رابطه با جداره آن :
یکی از سوالات مهم پیش رو اینست که آیا یک سلول خاص مثلا MSC آیا همیشه اگزوزومی با محتویات خاص ایجاد میکند یا اینکه بر اساس الگوریتم های ژنتیکی در پاسخ به وضعیت های مختلف محتوای اگزوزوم تغییر میکند ؛ این تئوری و فرضیه وجود دارد که MSC مثل یک سامانه خاص میتواند در شرایط خاص محتوای پروتئین ؛ نوکلئوتید داخل اگزوزوم های خود را تغییر دهد ؛ در این صورت ممکن است بتوان فرض کرد با تغییر فیزیکی شرایط محیط کشت و یا اضافه کردن بیو مولکول های خاص یا حتی اگزوزوم سلول های دیگر بتوان محتوا و عملکرد اگزوزوم ها را تغییر داد ؛ این موضوع خط پژوهشی مهم و قدرت درمانگری مهمی را برای ما ایجاد میکند که بتوان از محیط کشت MSC ؛ اگزوزوم های خاص منظوره تر را استخراج کرد که این یک برتری بسیار بزرگ تزریق اگزوزوم به جای خود سلول خواهد بود .
سوال بعدی در واقع استفاده از غشاء خاص اگزوزوم بعنوان حمل کننده موثر بیومولکول ها بداخل سلول ها است ؛ آیا میتوان با وارد کردن بیومولکول های خاصی به محیط کشت MSC یا سلول دیگر ؛ اگزوزوم های با محتوای این مواد بدست آورد و ایا میتوان اگزوزوم هایی را ساخت که سلول خاصی در بدن را نشانه رفته و داروها را فقط به آن وارد کنند ؛ این زمینه مطالعاتی نیز در صورت پیشرفت ؛ قدرت بزرگی را در زمینه درمان ایجاد میکند .
به هر حال درمان با اگزوزوم ابزار آینده پزشکی برای دستکاری و جهت دهی صحیح فرآیندهای سلولی بخصوص در درمان آسیب ها ؛ بیماری های خودایمنی ؛ سرطان ها ؛ بیماری های خود ایمنی می باشد .
بعد از این توضیحاتی که راجع به اگزوزوم داده شد ؛ اینجا این سوال کلیدی مطرح میشود که فرضیه مهم این تحقیق است : و آن این است که آیا تزریق اگزوزوم MSC میتواند آثار مشابه با تزریق سلول MSC داشته باشد ؟
اگر هدف از تزریق سلول لانه گزینی سلول در بافت و تکثیر و تمایز بعدی آن باشد حتما باید از خود سلول MSC اتوگرافت استفاده کرد اما ا گر هدف این باشد که یک سلول خاص بر روی سلول های دیگر تاثیر بگذارد ؛ میتوان صرفا از اگزوزوم آن استفاده نمود .
به صورت تئوریک البته مشخص شده که بخش بزرگی از تعامل و اعمال اثر سلول ها بر روی هم توسط اگزوزوم صورت میگیرد ؛ اما اینکه با تزریق وریدی یا حتی فرم استنشاقی اگزوزوم ها بتوانند همان اثراتی که سلول منشاء ایجاد میکند را ؛ داشته باشند سوال مهمی است و امکان آن پایداری اگزوزوم و امکان اثر دوربرد آن را نیازمند است .
اگر با استفاده از اگزوزوم بتوان به چنین تاثیراتی رسید چند مزیت بسیار مهم برای ما فراهم میشود :
اول : اینکه منطقا استفاده از اگزوزوم نسبت به سلول روشی است کم عارضه تر و یا حداقل با دغدغه کمتری از نظر آلوژنسیته در فرم آلوگرافت همراه است ؛ علاوه بر آن به جای تزریق یک سلول زنده هسته دار که ممکن است تغییراتی در عملکرد آن حادث شود ؛ صرفا یک کیسه داروئی با عملکرد قابل آزمون تری را وارد بدن بیمار نمودیم ؛ همچنین طول عمر اگزوزوم بسیار کمتر از سلول است ؛ اگرچه در مواردی این مسئله مطلوب نیست ؛ اما در ابتدای راه سلول درمانی بسیار مهم است که بررسی آثار دراز مدت و دغدغه ماندگاری تاثیر را حذف کنیم ؛ و بتوانیم یک عملکرد مشخص کوتاه مدت را بررسی نمائیم .
دوم : پائین تر بودن هزینه تولید اگزوزوم و نیز راحت تر بودن ذخیره آن است . اگزوزوم را میتوان با روش های مختلف فیزیکی سانتریفوژ و فیلتراسیون از محیط کشت سلولی جدا کرد و از یک محیط کشت چند بار اگزوززوم استخراج نمود . هم سلول و هم اگزوزوم برای ذخیره شدن باید فریز شوند که باید به سرعت و توسط نیتروژن مایع صورت بگیرد و در وضعیت فریز نگهداری شوند و در زمان استفاده باید با گرم کردن ملایم از حالت انجماد خارج شوند که برگشت به خات عادی یک کیسه پر از مواد مشخصا موفقیت آمیزتر از برگشت کل یک سلول زنده است .
سوم : فیلتراسیونی که برای جدا سازی اگزوزوم استفاده میشود عملا باعث حذف تمام پاتوژن ها میشود .
در بخش قرآوری فاکتورهای رشد دیدیم که استفاده از فاکتور رشد به جای پلاکت یک مزیت بزرگ ایجاد میکند : امکان استفاده از فیلتر 0.22 . این فیلتر اجازه عبور به هیچ پاتوژن ویروس یا باکتری را نمیدهد یعنی عملا سیال را استریل میکند مایع باشد یا گاز ( مثل اوزون ) . وقتی میخواهیم از سلول بنیادی مزانشیمی استفاده کنیم بخصوص در نوع به دست آمده از جفت ؛ باید بسیاری تستهای تشخیصی وجود پاتوژن و ویروسهای مختلف را انجام دهیم چون نمیتوانیم از این فیلتر استفاده کنیم چون سلول را هم رد نمیکند اما اگزوزوم را رد میکند ؛ پس با امکان رد کردن مایع محتوی اگزوزوم از فیلتر مایع کاملا استریل بدون دغدغه وجود پاتوژن به دست میآید .
چهارم : با توجه به اندازه کوچک اگزوزوم براحتی از سد خونی مغزی میتواند بگذرد و نتیجتا براحتی برای بیماری های سیستم اعصاب میتواند استفاده شود .
Free Cell Therapy
با توجه به موارد فوق در مورد هر سلولی بخصوص MSC اگر عملکرد بعنوان سلول و لانه گزینی و ایجاد بافت مد نظر باشد؛ از خود سلول استفاده میکنیم؛ اما اگر هدف استفاده از خواص سیستمیک یا تاثیر بر سلول های بافت خاصی مد نظر باشد؛ (بخصوص تنظیم سیستم ایمنی در مورد MSC) براحتی میتوان از اگزوزوم آن استفاده کنیم که اصطلاحاfree cell therapy نامیده میشود.
عوارض اگزوزوم تراپی :
در بررسی مقالات متعدد در مورد سلول درمانی با استفاده از MSC؛ و تزریق داخل وریدی آن ؛ به نظر میرسد هیچگونه عارضه جدی در مورد تزریق سلول های MSC حداقل در دوز طراحی شده یعنی یک میلیون سلول به ازای هر کیلوگرم از وزن بدن؛ وجود ندارد؛ البته مصرف همزمان با داروهای سرکوب کننده ایمنی منع شده و احتمال حوادث ترومبوتیک مطرح شده است؛ با توجه به نتایج حاصل از تزریق داخل وریدی MSC به نظر میرسد تزریق اگزوزوم از آن نیز بی عارضه تر بوده و حتی دغدغه ایمونوژنسیتی و نیز تاثیرات دراز مدت وجود نداشته باشد .
عملا هم در بررسی متون ؛ در هیچ یک از موارد تجربی یا بالینی ؛ اشاره ای به وجود عوارض در تزریق داخل وریدی اگزوزوم نشده است و در جستجوی اختصاصی عوارض ان نیز ؛ هیچ گونه عارضه ای ذکر نشده است و بعضا نیز به ایمن بودن آن تاکید کرده اند .
البته این روش درمانی نوپا بوده و به هر حال باید در مورد عوارض هوشیار بود ؛ به همین جهت بخش بررسی عوارض احتمالی در پرسشنامه ها منظور گردیده است ؛ چون عملا یکی از اهداف این مطالعه بررسی ایمنی safety این روش درمانی است .
microRNA ) , miRNA )
محتوای اختصاصی اگزوزوم میکرو RNA است . نقش microRNA به حدی است که امروزه در هر فرآیند سلولی مولکولی microRNA مربوطه هم مطرح میشود . microRNA با mRNA که باید با اتصال به ریبوزوم پروتئین خاصی را تولید کند باند شده و ساخت آن پروتئین خاص را مهار میکند و به نوعی تنظیم کننده سنتز پروتئینی خاص است و باعث ایجاد امکان تعادل سریع میشود یعنی وقتی به علت یک تحریک خاص سنتز پروتئینی سرعت میگیرد گاهی نمیتوان منتظر ماند تا فقط با کاهش تحریک پروتئین سازی کند شود و حالا برای متئقف کردن ساخت پروتئین و تنطیم سیستم microRNA وارد عمل میشود درست مثل حرکت ماشین با گاز دادن که گاهی ترمز گرفتن هم لازم است . در واقع مهمترین خاصیت حیات امکان تنطیم و کنترل تمام فرآیند ها است .
با شناخت ژنها و فرآیند تولید پروتئین تصور میشود ژنها فقط توالی پروتئینها را کد میکنند اما مشخص شد که درصدی از ژنها هم توالی microRNA را کد میکنند و درست با منطق بالا یعنی هم ژن برای ساخت پروتئین داریم هم ژنهادی برای توقف ساخت پرونئینهای خاص و این دقیقا همان چیزی است که از یک فرآیند حیات انتظار داریم . روند ساخت microRNA حتی از روند ساخت پروتئین هم پیچیدهتر است و پس از رونویسی یک رشته بلند RNA چندین مرحله را میگذراند تا تبدیل به یک رشته حدودا 20 نوکلئوتیدی شود که microRNA نهائی است و میتواند به بخشی از mRNA متصل شده و سنتز پروتئین خاصی را مهار کند .
اینکه چند درصد ژنها کد کننده microRNA از تخمین سه درصد تا حدود 9 درصد از کل 25000 ژن در بررسیهای مختلف ذکر شده است که البته با گذشت زمان این درصد به 9 درصد رسیده است . جالب اینکه ژن کد کننده بعضی مستقل و با پروموتور خاص خودش است ( به صورت مستقل یا چندتا باهم ) ژن بعضی داخل ژن خود پروتئین است یعنی بخشی از mRNA که اینترون نامیده میشود و در روند Splicing حذف میشود وارد روندی برای تولید microRNA میشوند .
برای اینکه نمائی از عملکرد microRNA ارائه شود تعدادی از پروسههای شناخته شده لیست میشود :
miRNAهای مهم در سیستم عصبی :
تعداد ژنها: 400-500 ژن
درصد از کل miRNAها: 20-25%
miRNAهای کلیدی نوروژنز:
miR-9: تنظیم تمایز نوروبلاستها
miR-124: القای نوروژنز
miR-125b: تنظیم نوروژنز بالغ
miR-132: پلاستیسیته عصبی
miR-212: یادگیری و حافظه
miRNAهای نورودژنراتیو
miR-9, miR-125b: آلزایمر
miR-7, miR-153: پارکینسون
miR-29: آمیلوتروفی جانبی
miR-206: میاستنی گراویس
miR-132, miR-212: مولتیپل اسکلروزیس
miRNAهای سیناپسژنز:
miR-134: سیناپسژنز
miR-138: پلاستیسیته سیناپسی
miR-125a: تشکیل سیناپس
miR-181: قوای ذهنی
miR-188: حفظ سیناپس
miRNAهای قلبی:
تعداد ژنها: 100-150 ژن
درصد از کل miRNAها: 5-8%
miRNAهای خاص: miR-1, miR-133, miR-208, miR-499
نقش: کاردیوژنز انقباض بازسازی
miRNAهای ایمنی:
تعداد ژنها: 200-250 ژن
درصد از کل miRNAها: 10-13%
miRNAهای خاص: miR-155, miR-146a, miR-21, miR-181
نقش: پاسخ ایمنی تمایز لنفوسیت التهاب
سلولهای بنیادی
تعداد ژنهای فعال: 300-400 ژن
miRNAهای خاص : miR-302, miR-371-373, miR-290-295
سلولهای سرطانی
ژنهای دگرگون شده: 500-600 ژن
oncomiRs: miR-21, miR-155, miR-221/222
tumor suppressor miRNAs: miR-15/16, miR-34, miR-200